Dr. Thierry Paluku d

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MEMOIRE DE DESA (Diplôme d’Etudes Supérieures Approfondies) EN NEUROSCIENCES ET GENETIQUE MOLECULAIRE 
 Dr Thierry PALUKU
 
Vendredi 20/04/2007 nous avons eu le plaisir de voir s’accroître la famille d’intellectuelles beniluberois. Notre confrère Dr PALUKU Thierry a défendu son MEMOIRE DE DESA (Diplôme d’Etudes Supérieures Approfondies) en NEUROSCIENCES ET GENETIQUE MOLECULAIRE à Casablanca au Maroc.
 
Voici pour le corps scientifique médical et étudiants en médecine l’important de ce travail laborieux de deux ans. Ci-joints donc le résumé et l’exposé.
 
R E S U M E
 
Le diagnostic des maladies génétiques est tributaire du développement et d’amélioration des outils de biologie moléculaire. Nous avons mis au point une technique moléculaire de diagnostic de l’amyotrophie spinale.
 
En effet, la SMA est une maladie neuromusculaire récessive caractérisée génétiquement par la délétion du gène SMN1 et, cliniquement par une hypotonie et atrophie musculaires consécutives à une dégénérescence des corps cellulaires des motoneurones de la corne antérieure de la moelle. 
 
L’étude a concerné 11 patients et une famille d’un cas index. Après extraction et dosage de l’ADN, une amplification des régions cibles par PCR suivie d’une digestion RFLP ont permis l’analyse de la délétion du gène SMN1 et sa copie centromérique SMN2.
En outre, nous avons complété notre étude par l’analyse de la délétion du gène NAIP par PCR multiplexe. La délétion de ce gène étant corrélée avec la sévérité de l’atteinte.
 
Nous avons détecté la délétion du gène SMN1 aussi bien chez 2 patients que chez 2 apparentés du cas index ayant bénéficié d’une enquête familiale. Aucun sujet n’a montré une délétion du gène NAIP.
 
Malgré la faiblesse de notre échantillon, notre étude a le mérite d’avoir mis au point pour le compte du service de neurologie et de neuropédiatrie une technique de diagnostic de biologie moléculaire à la fois simple, fiable et reproductible.
 
EXPOSE DU MEMOIRE DE DESA NEUROSCIENCES ET GENETIQUE MOLECULAIRE
 
A l’occasion de l’obtention du diplôme d’étude supérieur approfondie dans la spécialité : neurosciences et génétique moléculaire 
 
Le jury est constitué de :
 
Pr. Omar BATTAS, Professeur de psychiatrie et Directeur de l’UFR Neurosciences Cliniques, Président du jury,
Pr. Sellama NADIFI, Professeur de Génétique Médical et Directeur du laboratoire de génétique Médical, Rapporteur du mémoire,
Pr. I. SLASSI, Professeur de neurologie et chef de service de neurologie CHU Ibn Rochd, Examinateur,
Pr. Mohamed ITRI, Professeur de Pédiatrie et chef de service de neuropédiatrie, examinateur.
 
Chers Maîtres,
Chers collègues et honorable assistance,
 
Nous avons l’honneur ce jour (vendredi, 20/ Avril/ 2007 à 10h) de vous présenter notre sujet de mémoire initié dans le cadre du DESA en neurosciences cliniques et qui s’intitule « Etude moléculaire des amyotrophies spinales », travail réalisé sous la direction du Pr. Sellama NADIFI, MD-PHD, Professeur de génétique médicale et Directeur du laboratoire de génétique et pathologie moléculaire à la faculté de médecine et de pharmacie de Casablanca, Université Hassan II Ain Chock.
 
PLAN
Dans un premier temps, nous allons faire un bref aperçu sur la clinique et la génétique de l’amyotrophie spinale, suivi de la discussion de nos résultats obtenus.
 
DEFINITION
L’amyotrophie spinale appelée également SMA pour « spinal muscular atrophy » des anglons saxons est une maladie neuromusculaire autosomique récessive consécutive à la dégénérescence des corps cellulaires des motoneurones de la corne antérieure de la moelle et du bulbe rachidien.
Il s’ensuit une atrophie et une faiblesse musculaire avec déficit moteur.
 
EPIDEMIOLOGIE
C’est une maladie rare mais grave affectant 1 adulte sur 100000 dans sa forme Adulte et 1 enfant sur 6000 naissances.
Elle est la cause courante de décès d’origine génétique de l’enfant en pédiatrie après la mucoviscidose.
La deuxième cause des maladies neuromusculaires après la Dystrophie Musculaire de Duchenne.
 
CLINIQUE
On distingue 4 types suivant l’âge de début et la sévérité de maladie.
 
Le type I, forme sévère, survient avant 6 mois et évolue vers une insuffisance respiratoire précoce qui aboutit généralement au décès dans les 2 premières années de la vie.
 
Le type II, forme intermédiaire, apparaît avant l’âge de 18 mois.
Généralement, l’enfant ne pourra pas marcher pas marcher, donc reste confiné dans un fauteuil roulant.
Dans son évolution, on note une défaillance respiratoire nécessitant parfois une assistance respiratoire permanente voir une trachéotomie.
Des déformations ostéo-articulaires aboutissant à un handicap moteur sévère.
 
Le type III, forme modérée, chronique et bénigne de la maladie. Apparaît tardivement entre 2 et 17 ans par la perte progressivement des acquisitions motrices. Elle est compatible avec une vie normale.
 
Enfin le type IV, forme de l’adulte, survient entre 30 et 50 ans. Une atteinte respiratoire et possible. Elle est la moins grave et moins documentée.
 
EXAMENS COMPLEMENTAIRES
 
L’atteinte neurogène de la maladie est déterminée par l’EMG.
La biopsie musculaire permet de distinguer l’amyotrophie spinale des autres myopathies congénitales.
Malheureusement ces 2 tests restent invasifs. D’où l’intérêt d’un examen génétique, non seulement par son caractère inoffensif mais surtout permet de confirmer le diagnostic de certitude de la maladie.
 
GENETIQUE DE LA SMA
Le gène dont la mutation est responsable de la maladie a été localisé sur le bras long du chr 5q11-q13.
C’est une région complexe et instable caractérisée par une duplication inversée de 3 gènes qui ont été identifiés du coté centromérique du même chromosome 5.
Il s’agit :
           Du gène SMN, gène déterminant de la maladie puisque ses anomalies se rencontrent à 98% dans la SMA.
           le gène NAIP et le gène P44 impliqués respectivement dans 30% et 15% des formes sévères de la maladie. Ces deux gènes ne semblent pas jouer un effet direct sur la survenue de la maladie, puisque leur délétion a été rencontrée chez des personnes saines c à d non SMA. Ils sont plutôt considérés comme des marqueurs de la sévérité dans la SMA.
 
GENE SMN
Le gène SMN comprend 2 copies ; SMN1 et SMN2. Ces 2 gènes ont la même structure et le même cadre de lecture.
C’est un petit gène de 28kb, donnant un transcrit de 1.7Kb codant pour la protéine SMN fonctionnelle.
 
Le gène SMN2, copie centromérique, diffère seulement sur 5 nucléotides dont 2 sur l’exon 7 et l’exon 8. par un épissage alternatif, le gène SMN2 donne lieu à 2 types des transcrits l’un ne possédant pas l’exon 7 (SMND7) et donne à 80% une protéine SMN tronquée, courte et instable.
Et l’autre transcrit donne 20% d’une protéine normale fonctionnelle.
 
 
Malheureusement, cette quantité n’est pas suffisante pour compenser l’absence de SMN1 dans la SMA.
 
LA PROTEINE SMN
 
Est d’expression ubiquitaire et intervient dans la synthèse des spliceosomes, ensembles ribonucléiques impliqués dans le cycle complexe de la maturation des ARNm dont probablement ceux qui sont indispensables à la survie du motoneurone.
Rôle synergique anti-apoptique en association avec d’autres protéines comme le NAIP, le Bcl-2.
 
La réduction ou l’absence de l’activité anti-apoptique serait l’un des aspects physiopathologiques essentiels de la SMA.
 
OBJECTIFS
 
L’objectif de notre étude est de confirmer le diagnostic clinique de l’amyotrophie spinale par la détection de la délétion homozygote du gène SMN et du gène NAIP.
En vue d’une mise en route d’une thérapeutique précoce prévenant ainsi les complications, mais aussi,
La détection des anomalies génétiques donne des précieuses informations pour le conseil génétique.
 
PATIENTS ET METHODES
 
Notre étude a concerné 11 patients et 4 apparentés d’un cas index ayant bénéficié d’une enquête familiale référés par les services de neurologie et de pédiatrie du CHU ibn Rochd et, chez qui le diagnostic d’amyotrophie spinale a été retenu.
 
La méthode au phénol-chloroforme a été utilisée pour l’extraction de l’ADN génomique suivie d’un dosage de l’ADN pour non seulement quantifié l’ADN mais surtout évaluer sa qualité condition essentielle pour un bon rendement d’une étude moléculaire.
La méthode par PCR-RFLP a permis d’analyser les exons 7 et 8 du gène SMN1 couramment délaités dans la SMA.
Une digestion enzymatique à l’aide des enzymes Dra I pour l’exon 7 et Dde I pour l’exon 8 a permis de distinguer le gène SMN1 de sa copie centromérique SMN2.
A l’aide d’une PCR MULTIPLEX, la délétion homozygote du gène NAIP a été recherchée à travers l’amplification des exons 4 et 5 exclusivement présent dans le gène intact et fonctionnel et l’exon 12 comme contrôle interne.
 
RESULTATS MOLECULAIRES.
 
-Pour le gène SMN, les fragments d’amplification pour l’exon 7 et l’exon 8 sont de 188pb et ne nous permettent pas de distinguer s’ils sont d’origine SMN1 ou de sa copie centromérique SMN2, pour cela une digestion s’impose.
 
POUR L’EXON 7 :
 
L’introduction d’une mutation ponctuelle par PCR, on parle alors d’une mutagenèse dirigée crée un site de restriction Dra I :
En introduisant le nucléotide A en vert sur les schémas ci haut au niveau de l’exon 7. Le troisième nucléotide T en rose de la séquence est présent seulement dans le gène SMN2 et c’est un C dans le gène SMN1.
L’enzyme Dra I coupe seulement le produit PCR de l’amplification du gène SMN2 et laisse tranquille le produit d’amplification du gène SMN1.
2 cas de figure se présentent après digestion sur le gel d’agarose de contrôle:
 
– En cas d’allèles normaux et délétions hétérozygotes du gène SMN1 : 2 fragments sont présents :
       – 1 fragment de 188pb= non digéré correspondant au gène SMN1
       – 1 autre fragment de 164pb= digéré= du gène SMN2
-Allèles avec délétions homozygotes SMN1 : on a 1 seul fragment de 164pb digéré correspond au gène SMN2.
 
POUR L’EXON 8
 
Un nucléotide permet la distinction du gène SMN1 de sa copie centromérique : G>A. il s’agit du G dans le gène SMN1 et A en rose sur l’image pour le gène SMN2. la base A crée un site de restriction reconnue par l’enzyme Dde I laquelle digère le produit PCR SMN2 en 2 sous produits.
Le produit PCR amplifié de l’exon 8 du gène SMN1 ne contient pas de site Dde I et a une taille de 188pb.
2 cas de figure se présentent après digestion DdeI :
– en cas d’allèles normaux et délétions hétérozygotes du gène SMN1 : 3 fragments :
            – 188pb non digéré correspondant au gène SMN1
            – 123pb et 65pb digéré du gène SMN2
– en cas d’allèles avec délétions homozygotes du gène SMN2 : on a seulement 2 fragments comme le montre la figure ci bas:
             – de123pb et 65pb digéré du SMN2
LE GENE NAIP
L’étude moléculaire de la délétion du gène NAIP a été étudiée par PCR multiplex des exons 4,5 et 12. Les produits Pcr sont différenciés par leur taille sur le gel d’agarose.
On obtient 3 fragments distingués par leur taille et leur vitesse de migration électrophorétique.
2 cas de figure :
Allèles normaux : présence des 3 fragments de l’exon 4 : 436pb ; exon 12 ; 242pb et exon 5 : 128pb.
COMPARAISON DES RESULTATS
Bien que plusieurs travaux ont rapportés une fréquence élevée de la délétion homozygote du gène SMN1 dans la SMA allant de 83 par l’équipe de RABAT à 100% en TAIWAN.
Notre série a trouvée une faible fréquence de la délétion soit 2 sur 11 correspondant à 18.1%.
DISCUSSION
Alors que la découverte de la délétion de l’exon 7 et /8 du gène SMN1 est un argument positif en faveur du diagnostic de certitude de la SMA. La faible fréquence de la délétion dans notre série pourrait s’expliquer par :
           soit la faiblesse de notre échantillon
           soit qu’il s’agit d’autres maladies de la corne antérieure apparentées aux SMA notamment les scléroses latérales amyotrophiques sporadiques ou familiales ou encore la poliomyélite.
           Soit encore des cas rares des mutations ponctuelles dans les gènes SMN1 malheureusement non détectées par notre technique.
 
CORRELATION GENOTYPE ET PHENOTYPE
 
Nous avons notés l’absence des corrélations entre le phénotype et le génotype chez le cas index avec ses apparentés. Bien que la délétion homozygote du gène SMN1 a été retrouvée mais avec une clinique et l’âge de début différents : sévères et précoce pour le cas index dont nous avons déploré le décès à l’âge de 5 ans et, modérée et relativement tardive pour ses 2 apparentés.
3 mécanismes génétiques sont évoqués pour expliquer ces phénomènes :
– l’étendue de la délétion. En effet, les grandes délétions sont observées dans les formes sévères, pouvant emporter les éléments de régulation de l’expression du gène centromérique ou emporter un autre gène proche du gène SMN dont le gène NAIP.
– le nombre des copies du gène SMN2 avec un nombre élevé pour les formes modérées et bas pour les formes sévères.
– enfin, le mécanisme de conversion du gène SMN1 en SMN2 conduisant à la formation d’un gène chimérique ou hybride a été également évoqué.
 
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
 
L’analyse du gène SMN constitue un outil diagnostic permettant de confirmer le diagnostic clinique de SMA.
Notre technique par PCR-RFLP est une méthode sensible, rapide et reproductible.
Notre travail a le mérite de mettre à la disposition des cliniciens une technique de génétique moléculaire pouvant servir dans la routine.
Le seul inconvénient, il ne nous a pas permis la détection des délétions hétérozygotes notamment chez les parents du cas index ou encore, les mutations ponctuelles pouvant être à l’origine de la SMA.
Recommandons une étude par PCR quantitative permettant le comptage des nombres des copies du gène SMN2 indispensable dans le cadre du conseil génétique et le diagnostic prénatal éventuel.
Enfin, une analyse génétique d’une grande série d’individus en vue de déterminer la prévalence de la maladie au MAROC.
 
Je vous remercie.
 
Fait à Casablanca, le 20/ 04/ 2007
 
Dr Thierry PALUKU THEY-THEY 
Génétique Médicale et Neurosciences
Laboratoire de génétique médicale et pathologie Moléculaire
Chef de l’équipe chargé de la recherche des marqueurs génétiques
Des AVC ischémiques.
 
Correspondance de Serge BAHATI
Casablanca / Maroc.
Beni-Lubero Online

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